波音727-100C于1964年8月對外發布，并在727機身上作出重要改動。727-100C設有高86呎、寬134呎的貨門，加強了地板厚度，最多可裝載八個集貨箱。飛機所有機門和緊急逃生門并沒有改動。
波音727-100C能夠根據客貨量需求，改裝為客機、貨機或客貨混合型，只需兩小時便完成改裝。-100C的在雙座艙配置下，載客量為94人，貨機型最多可負載36,750磅的貨物；而客貨混合型則可同時運載52人及四個集貨箱共24,000磅的貨物，飛機前面為貨艙，后面為客艙。-100C最初的起飛重量為160,000磅，但經過強化中心剖面和起落架后，提升至169,000磅。
波音727-100C的首個客戶為西北東方航空，接著是漢莎航空、聯合航空、布蘭尼夫國際航空、泛美航空、美國東方航空和環球航空。首架727-100C于1965年12月30日首飛，翌年4月取得適航證，4月13日交付給西北東方航空。
